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Los tejidos son en general incoloros, excepto aquellos que poseen algún pigmento como la hemoglobina de la sangre o la melanina de la epidermis, lo cual dificulta la delimitación celular y la discriminación entre diferentes tejidos.¹

Después de la segunda etapa de IHQ, fijación, se añadirán anticuerpos a la muestra para que reconozcan y se unan específicamente a la molécula tisular capaz de desarrollar una respuesta inmune. Se basa en la alta especificidad de la unión de los anticuerpos a los antígenos contra los que se produjeron.¹

Elementos Previos:

Rotular laminillas
Diluir anticuerpos

Tinción

Enjuague
Delimitar laminillas
Bloquear proteínas inespecíficas
Aplicar Anticuerpo Primario
Aplicar Anticuerpo Secundario
Aplicar Cromógeno
Contraste
Deshidratar Laminillas
Montar Laminillas

Rotular laminillas

Según las diluciones.

Diluir anticuerpos

Utilizamos Diluyente Da Vinci Green ph de 7.2.

El diluyente de anticuerpos que tiene un ph de 7.2, generalmente tiene una colorimetría verde porque es el universal.

Trucos del proceso para diluir anticuerpos

El ambiente acuoso influye en gran medida en la conformación de los anticuerpos. Al preparar soluciones de trabajo de anticuerpos concentrados, es importante seleccionar un diluyente que no altere la estabilidad y las propiedades de unión del anticuerpo. La carga, la hidrofobicidad y otras propiedades fisiológicas / químicas pueden afectar las combinaciones de anticuerpos y diluyentes.

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Tinción

ENJUAGUE

Existen dos pasos previos que no están incluidos en el protocolo de la tinción.
Sin embargo, realizar estos procesos impactará positivamente la calidad de la tinción.

Se puede aplicar en la cámara húmeda o sumergir las laminillas.

Bloqueador de Peroxidasa por 5 min.
Peróxido de hidrogeno, (agua oxigenada) al 3%
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WASH Buffer: PBS con detergente por 3 min.
Para quitar exceso de peroxido de hidrogeno.

💧Las laminillas siempre deberán estar en un ambiente húmedo.

🚫 Las laminillas no deben secarse durante el proceso de IHQ.

Delimitar laminillas

Es necesario delimitar las laminillas para mantener las disoluciones únicamente en las regiones de interés ²

Quitar el exceso de humedad con papel absorbente, sin tocar el tejido.
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Marcar frente de laminillas con Super Pap Pen
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Marcar reverso con marcador permanente azul – para poder ver el área delimitada sobre la cámara húmeda.
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Se coloca Wash Buffer mientras marcamos el resto de las laminillas para que no se sequen.